水稻中苯甲酸含量的测定

液相色谱法

1  方法提要

试样经水提取，经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。

2  试剂和材料

注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。

2.1甲醇：色谱纯（天地）；

2.2乙酸铵：色谱纯（国药）；

2.3亚铁氰化钾：分析纯（国药）；

2.4乙酸锌：分析纯（国药）；

2.5 冰乙酸：分析纯（阿拉丁）；

2.6 亚铁氰化钾溶液（92g/L）:：称取106g亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1000mL。

2.7 乙酸锌溶液（183g/L）：称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30mL冰乙酸，用水定容至1000mL。

2.8 乙酸铵溶液（20mmol/L）：称取1.54g乙酸铵，加入适量水溶解，用水定容至1000mL，经0.22µm水相微孔滤膜过滤后备用。

2.9苯甲酸标准品：纯度≥98%；

2.10标准物质溶液；

2.10.1苯甲酸标准储备溶液（1000mg/L）：准确称取10mg（精确到0.01mg）苯甲酸标准品，用甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混匀，4℃保存，有效期6个月。

2.10.2 苯甲酸标准工作液：准确吸取适量的苯甲酸标准储备液，用水稀释成 1mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，50 mg/，100 mg/L的标准工作溶液。

3 仪器和设备

3.1液相色谱仪：岛津LC 20A，配有二极管阵列检测器；

3.2 分析天平：梅特勒-托利多XA204；

3.3 涡旋振荡器：美国VORTEX-GENIE 2；

3.4 超声机：昆山市超声仪器有限公司KQ-500DE型；

3.5固体样品粉碎机：瑞典FOSS公司 foss

3.6离心机：Hettich 

4 试样制备与保存

将试样机械粉碎，混匀至于密闭容器中冷冻保存。

5 测定步骤

5.1提取

称取0.5g（精确至0.001g）的试样，置于10mL离心管中，加水5mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声提取20min后，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液0.5mL和乙酸锌溶液0.5mL，混匀，于5000r/min 离心5min，将水相转移至10mL容量瓶中，于残渣中加水4mL，涡旋混匀后超声5min,于5000r/min 离心5min,将水相转移至同一容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取上清液过0.22µm微孔滤膜作为待测液。

5.2液相色谱法测定

5.2.1 条件

a）色谱柱：C18；柱长250mm，内径 4.6mm，粒径5µm；

b）流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95

c）流速：1.0mL/min；

d）检测波长：230nm；

e）进样量：10μL；

f）柱温：40℃；

g）化合物的名称及保留时间，参见表1。

表1 

化合物 保留时间（min）

苯甲酸 6.663

6 本方法的样品测定数据

本方法的样品测定的含量如下，结果保留三位有效数字，详细含量见表2。

表2 

样品编号 浓度（mg/L） 含量（g/kg）

Noninfect (未侵染组）-1 0.991 0.0197 

Noninfect (未侵染组）-2 0.926 0.0185 

Noninfect (未侵染组）-3 0.915 0.0183 

Infect（侵染组)-1 0.039 0.000780 

Infect（侵染组)-2 0.036 0.000720 

Infect（侵染组)-3 0.047 0.000938 

HWD-2(菌丝)-1 0.053 0.00105 

HWD-2(菌丝)-2 0.038 0.000760 

HWD-2(菌丝)-3 0.015 0.000303 

7方法的线性范围

在本方法的分离条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行测定，以标准工作液的峰面积对质量浓度绘制标准工作曲线，方法的线性范围及相关系数见表3

表3 

化合物 线性范围（mg/L） 回归系数 线性方程

苯甲酸 0-100 0.9999714 Y=36753.5X

8 图谱

苯甲酸色谱图