尼古丁是烟草中的主要致瘾性生物碱，可替宁作为其主要代谢产物，半衰期长、检测稳定，是评估烟草暴露水平的核心生物标志物。随着尼古丁对胰腺等非传统靶器官毒性研究的深入，建立组织特异性的尼古丁和可替宁精确定量检测方法已成为迫切需求。本文系统综述了液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）在生物组织中检测尼古丁和可替宁的研究进展。首先，梳理了尼古丁的体内代谢特征和可替宁作为生物标志物的应用现状，分析了组织基质检测相较体液检测面临的技术难点。其次，从样品前处理（蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取）和色谱分离策略（反相C18、苯基-己基π-π作用、HILIC亲水相互作用）两个维度比较了不同技术路线的优劣，重点讨论了MRM双离子对监测在定性质谱确证中的应用价值。在此基础上，以安逸生物科技有限公司开发的HILIC-UPLC-MS/MS方法为核心案例，详细阐述了其在小鼠胰腺组织检测中的方法学创新，包括Amide色谱柱的HILIC保留策略、超声提取-冻干浓缩的前处理方法、以及基于岛津LC-MS-MS-8050平台的MRM参数优化。最后，结合多时间点药代动力学实验数据评估了方法的实际应用性能，并提出了引入同位素内标、扩展代谢物检测范围等未来优化方向。本文旨在为尼古丁靶器官毒性机制研究和组织药代动力学评估提供方法学参考。
前言
尼古丁（nicotine）是烟草中含量最为丰富的生物碱，约占烟草生物碱总量的95%以上 [1]。作为烟草成瘾的主要活性成分，尼古丁通过激活烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）对中枢和外周神经系统产生广泛影响 [2]。尼古丁还可诱导胰腺等消化器官的氧化应激和炎症反应，其在动物实验中被证实可改变胰腺外分泌功能 [3]。尼古丁进入体内后，约70%80%在肝脏经细胞色素P450酶系（主要为CYP2A6）代谢为可替宁（cotinine），后者半衰期约为1520小时，远长于尼古丁的1~2小时 [4]。因此，可替宁作为尼古丁暴露的主要生物标志物，在烟草暴露评估、戒烟治疗监测及被动吸烟流行病学调查中被广泛应用 [5]。尿液中可替宁浓度的测定已被广泛验证为环境烟草烟雾暴露的定量生物标志物，其检测窗口覆盖暴露后数天至一周 [6]。
近年来，随着电子烟等新型烟草制品的普及以及尼古丁对胰腺等非传统靶器官毒性效应研究的深入，对生物组织中尼古丁及其代谢物的精确定量检测提出了更高的技术要求 [3]。液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）凭借其高灵敏度、高选择性和多组分同时分析能力，已成为生物样品中尼古丁和可替宁定量检测的金标准技术 [7]。近年来，微样本采集技术（如干血斑、微量血浆采样）结合LC-MS/MS平台的生物监测方案也逐步发展，进一步降低了检测所需的生物样本量 [8]。
然而，目前国内外对尼古丁和可替宁的LC-MS/MS检测主要集中在血液、尿液、唾液等体液基质中 [9]，针对生物组织——尤其是胰腺等药代动力学研究靶器官——的标准化检测方法尚属空白。已有研究指出，血浆浓度难以准确反映靶器官的药物暴露水平，发展组织特异性检测技术对于药效学和毒理学研究具有重要价值 [10]。安逸生物科技有限公司基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱平台，首次开发了小鼠胰腺组织中尼古丁和可替宁的HILIC-MRM双离子对检测方法，并结合多时间点药代动力学实验设计进行了初步应用验证。
本文旨在综述LC-MS/MS技术在生物组织中尼古丁和可替宁检测的研究进展，在系统梳理样品前处理、色谱分离策略和质谱检测关键技术的基础上，重点介绍安逸生物公司在组织检测方法开发中的技术创新，并展望该方法在尼古丁药代动力学研究中的应用前景。与基于酶联免疫分析（ELISA）和GC-MS的传统尼古丁检测方法相比 [11]，LC-MS/MS方法在选择性、灵敏度和多组分同时分析能力上具有显著优势，已成为生物监测领域的主流选择。
一、尼古丁和可替宁的理化性质及检测挑战
1.1 尼古丁的体内代谢过程与生物标志物意义
尼古丁（3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶，分子式C₁₀H₁₄N₂，分子量162.23）为无色至淡黄色油状液体，具有叔胺碱性，其吡啶环上氮原子的pKa约为3.12，吡咯烷环上氮原子的pKa约为8.02 [1]。这一弱碱性特征决定了尼古丁在生理pH条件下主要以离子化形式存在，对其在生物基质中的提取和色谱保留行为具有重要影响。该理化性质也解释了为何较早的文献方法多采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行尼古丁测定——GC-MS需要衍生化或碱性萃取使分析物以游离碱形式挥发 [12]。
尼古丁经吸入或摄入后迅速分布于全身各组织，动物实验数据表明其组织-血浆浓度比通常大于2，表明尼古丁具有显著的组织蓄积倾向。在肝脏中，尼古丁主要由CYP2A6酶催化经C-氧化生成可替宁，这一代谢途径约占尼古丁总清除率的70%~80% [4]。可替宁进一步在体内代谢为反式-3'-羟基可替宁，后者与可替宁的比值被称为尼古丁代谢率（Nicotine Metabolite Ratio, NMR），是反映个体CYP2A6酶活性的重要内表型指标 [13]。近年研究显示，CYP2A6基因多态性和酶活性差异对尼古丁的药代动力学和成瘾风险具有显著影响 [14]。
在生物标志物应用层面，可替宁因半衰期长（15~20小时）、检测窗口稳定，已被世界卫生组织推荐为环境烟草烟雾暴露评估的一线生物标志物 [5]。以血清或尿液为基质的可替宁检测方法已在多个大规模流行病学队列中验证应用，包括美国国家健康与营养调查（NHANES）和烟草与健康人口评估（PATH）研究 [9]。除可替宁外，尿液中的尼古丁代谢物组合（包括尼古丁-N-氧化物、尼古丁葡萄糖醛酸苷等）也为更精细的暴露分型提供了可能 [15]。此外，基于新生儿干血斑的加合物组学分析可从生命早期暴露角度反映母体孕期吸烟对后代氧化应激的影响，为可替宁作为生命历程流行病学生物标志物提供了新的应用视角 [16]。然而，在组织靶器官水平的尼古丁/可替宁暴露评估中，血液和尿液浓度无法直接反映组织局部的药物暴露水平，亟需建立组织特异性定量检测方法 [3]。新近研究采用同位素标记尼古丁在动物模型中进行代谢组学追踪，证实了组织局部尼古丁暴露与系统性生物标志物浓度之间的显著差异 [17]。
1.2 生物基质中微量尼古丁检测的技术难点
与血液、尿液等相对清洁的体液基质相比，生物组织样本的尼古丁和可替宁检测面临多方面的技术挑战。首先，组织基质的复杂性显著增加。生物组织含有大量蛋白质、脂质、磷脂和细胞碎片，这些内源性成分在LC-MS/MS分析中可产生严重的基质效应，导致目标分析物的离子抑制或增强，从而影响定量准确性 [7]。研究表明，未经有效前处理的组织提取液中，磷脂类物质的浓度可达mg/mL水平，对ESI源中的目标物离子化效率产生显著干扰 [18]。
其次，组织样品的前处理流程更为繁琐。组织样本需经过匀浆破碎、溶剂提取、蛋白沉淀、固相/液液净化等多个步骤，每一步操作均可能引入回收率损失和操作偏差 [2]。在烟草生物碱类似物（如安纳巴松）的血浆检测中，类似的前处理挑战已被系统研究，提示碱性生物碱类药物在生物基质分析中普遍面临pH依赖性提取效率和蛋白结合干扰等问题 [19]。此外，尼古丁和可替宁均为极性小分子，在传统反相液相色谱（RPLC）C18柱上保留极弱，保留因子（k'）通常小于1，导致其与基质中极性内源性成分共洗脱，难以实现有效分离。如何选择合适的色谱保留机制——如亲水相互作用色谱（HILIC）、离子对色谱或混合模式色谱——成为方法开发中的关键决策 [20]。
第三，组织样本量通常有限，在小鼠药代动力学实验中，单只动物的胰腺组织湿重通常不足0.2克，对检测方法的绝对灵敏度提出了较高要求。如何在有限的样本量下实现低至ng/g水平的定量检测，需要在微量样品处理、提取富集策略和仪器灵敏度之间取得平衡 [21]。
二、LC-MS/MS 检测生物样品中尼古丁和可替宁的关键技术要素
2.1 样品前处理方法的选择与优化
样品前处理是生物基质中尼古丁和可替宁定量分析的决定性环节，直接关系到方法的灵敏度、回收率和基质效应控制 [7]。目前文献中报道的前处理方法主要包括蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法三大类。
蛋白沉淀法操作最为简便，通常以乙腈或甲醇为沉淀剂，按1:3~1:5的体积比与样品混合后离心取上清，适用于高通量检测需求。在血液和尿液等低复杂度基质中，蛋白沉淀法能实现>80%的回收率和<15%的基质效应。但该方法净化程度有限，对于组织等高复杂基质，磷脂共提取严重，常导致>30%的离子抑制 [18]。
液液萃取法利用分析物在有机相和水相之间的分配系数差异实现选择性提取，是组织样本前处理的常用策略。早期研究多采用氯仿、二氯甲烷等氯化溶剂，近年来以甲基叔丁基醚（MTBE）和乙酸乙酯为代表的绿色溶剂逐渐成为主流 [2]。在碱性条件下（pH>9），尼古丁和可替宁以分子形式存在，可有效被有机相萃取。有研究比较了乙酸乙酯、二氯甲烷和MTBE三种萃取溶剂对血浆中尼古丁/可替宁的回收率，结果显示乙酸乙酯的绝对回收率最高（85%~95%），但提取物的基质效应也最为显著（离子增强达120%）[21]。
固相萃取法（SPE）提供了最为彻底的基质净化效果。混合模式SPE柱（如Oasis MCX、Bond Elut Plexa PCX）利用反相保留和阳离子交换的双重作用机制，对碱性药物具有优异的选择性和回收率。支撑液液萃取（SLE）作为传统LLE的改良技术，也被成功应用于尿液中多种烟草暴露标志物的同时检测，操作简便且乳化风险低 [22]。Mochizuki等人 [23] 采用MCX SPE柱处理人血浆样本，尼古丁和可替宁的绝对回收率分别为87.7%和105.8%，基质效应控制在±15%以内。近期研究进一步引入了QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）策略，通过分散固相萃取快速净化组织提取液，Shin等人 [24] 将该方法用于猪组织中尼古丁残留检测，LOQ低至5 ng/g，回收率在80%~110%之间，展示了QuEChERS在组织检测中的应用潜力。
对于小鼠胰腺等微量组织样本，安逸生物公司采用甲醇-乙腈（1:1, v/v）混合溶剂进行超声辅助提取，经高速离心后取上清液冷冻干燥浓缩10倍，再以0.22 μm滤膜过滤进样。该前处理流程兼顾了提取效率（超声30分钟确保组织内分析物充分释放）和灵敏度增强（冻干浓缩），同时避免了SPE的额外成本和时间消耗，在成本控制与数据质量之间取得了良好平衡。
2.2 色谱分离与质谱检测条件的建立与优化
色谱分离策略的选择直接影响尼古丁和可替宁的分析选择性。传统的反相C18柱（如Waters BEH C18、Agilent Zorbax SB-C18）对小分子极性碱性化合物的保留能力有限。为改善保留行为，文献中普遍采用了三种替代策略 [20]。
第一种策略是在反相条件下使用全水流动相（100% aqueous mobile phase）配合特殊设计的耐水C18或C8色谱柱，Shin等人 [24] 采用Waters Atlantis T3柱（100%水相耐受型）实现了对人血浆中尼古丁和可替宁的基线分离。第二种策略是利用苯基-己基固定相的π-π相互作用增强对含氮芳香环化合物的保留，Arunkumar等人 [25] 采用Agilent Eclipse Plus Phenyl-Hexyl色谱柱，在等度洗脱条件下将可替宁和3-羟基可替宁的保留时间控制在24分钟，LOD低至0.005 ng/mL [25]。第三种策略——也是安逸生物公司选择的技术路线——是采用亲水相互作用色谱（HILIC）。HILIC色谱以极性固定相（如酰胺基、硅胶、两性离子）和含高比例有机溶剂的流动相为特征，对极性化合物具有优异的保留和分离能力。近年来，基于自动化液液萃取或在线SPE的LC-MS/MS方法进一步提高了分析通量，有研究开发了血清中可替宁与3-羟基可替宁的全自动在线分析方法，单次运行时间缩短至6分钟以内，体现了方法自动化的最新趋势 [26]。与其他两类策略相比，HILIC模式具有以下优势：（1）对尼古丁等强极性碱性化合物的保留因子显著高于反相模式；（2）高有机相流动相有利于ESI源的离子化效率，可提升质谱灵敏度；（3）HILIC的洗脱顺序与反相相反，极性内源性干扰物（如氨基酸、糖类）在HILIC柱上的保留强于目标分析物，有利于减少基质共流出 [20]。在植物生物碱的多组织分布研究中，HILIC-UPLC-MS/MS已被证明可同时检测罂粟中多种异喹啉生物碱在根、茎、叶、蒴果中的分布，展示出优良的组织穿透性和方法通用性 [27]。一项系统比较研究显示，对于含氮极性药物，HILIC模式在峰对称性（As < 1.2, vs 反相 As > 2.0）和质谱响应（信号增强25倍）方面均表现出显著优势 [28]。
在质谱检测方面，ESI正离子模式是尼古丁和可替宁测定的首选电离方式。在MRM模式下，尼古丁的特征离子对为m/z 163.1→130.1（定量）和 163.1→117.0（定性），可替宁的离子对为m/z 177.1→80.1（定量）和 177.1→98.1（定性）[23]。安逸生物公司的检测方案中，每个化合物均设定了一对定量离子和一对定性离子，并给出了详细的MRM参数（Q1碰撞电压、碰撞能、Q3碰撞电压及驻留时间），符合欧盟2002/657/EC决议对质谱确证的"4分"鉴定标准。这一双离子对策略有效避免了单一离子对监测可能导致的假阳性结果，确保了方法的鉴定特异性。以岛津LC-MS-MS-8050三重四极杆质谱为检测平台，配合UF-MRM超快速极性切换技术，该仪器可实现每秒超过500个MRM通道的数据采集，为多组分高通量检测提供了硬件基础。近年基于LC-MS/MS平台的气化药物经皮渗透研究（如纳洛酮）也采用了类似的分析策略和仪器条件，验证了该平台在复杂基质中痕量药物分析方面的技术成熟度 [29]。
三、安逸生物公司小鼠胰腺组织检测方法的创新与应用
3.1 HILIC-MRM双离子对策略在组织检测中的方法学创新
安逸生物科技有限公司针对小鼠胰腺组织中尼古丁和可替宁检测这一技术空白，建立了一套完整的HILIC-UPLC-MS/MS定量分析方法。
在色谱分离策略上，公司选用Waters ACQUITY UPLC Amide色谱柱（100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm），以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，采用多梯度程序洗脱（有机相比例变化：95%→95%→70%→50%→30%→95%），流速0.3 mL/min，柱温35°C，进样量1 μL。Amide色谱柱的酰胺基固定相通过氢键作用、偶极-偶极作用和弱离子交换作用对尼古丁和可替宁实现选择性保留，多阶梯度设计覆盖了从高有机相（促进极性分析物与固定相的亲水分配）到高水相（洗脱）的完整HILIC保留过程，体现了对HILIC色谱机理的系统性理解。
与文献中常见的反相方法相比，该HILIC方法具有以下优势：（1）高乙腈比例的初始流动相有利于ESI源中带电液滴的去溶剂化，提升离子化效率；（2）Amide柱对极性小分子具有良好的峰形表现（As < 1.5），克服了反相模式中尼古丁拖尾严重的问题；（3）HILIC模式将氨基酸、有机酸等极性内源性成分保留至更晚的洗脱窗口，减少了与目标分析物的共流出干扰 [28]。
在样品前处理方面，公司开发的流程充分体现了微量组织检测的专业考量：取0.1 g胰腺组织，以1 mL甲醇-乙腈（1:1, v/v）为提取溶剂，超声提取30分钟以保证尼古丁和可替宁从组织基质中充分释放。提取液经10000 r/min高速离心5分钟去除组织碎片和变性蛋白后，取上清液进行冷冻干燥。冻干的提取物以100 μL甲醇-乙腈（1:1）复溶，实现10倍浓缩，最后经0.22 μm微孔滤膜过滤进样。这一前处理流程的关键创新在于超声提取与冻干浓缩的联用策略：超声提取弥补了简单振荡提取对组织内分析物释放不充分的缺陷，冻干浓缩则在不额外引入有机溶剂的前提下显著提升了方法的富集倍数，使低丰度样本（如24小时代谢清除后的组织样本）仍能实现可靠定量。
在质谱条件方面，公司以岛津LC-MS-MS-8050为检测平台，采用ESI正离子模式和多反应监测扫描模式，为每个目标化合物设定了一对定量离子对和一对定性离子对。详细优化的MRM参数包括：三层温度控制系统（接口温度250°C、DL管温度350°C、加热模块温度300°C）和完整的气体参数（干燥气10.0 L/min、加热气10.0 L/min、雾化气3.0 L/min、碰撞气270 kPa）。该参数体系通过阶梯式加热实现温和去溶剂化的同时保护热不稳定分析物，展示了成熟的方法优化理念。
定量策略方面，公司采用外标法校准，以7点标准曲线覆盖10~1000 ng/mL的线性范围。值得注意的是，文献中绝大多数成熟方法均使用稳定同位素内标（如尼古丁-d₃、可替宁-d₃）来补偿基质效应和前处理损失 [23] [25]，公司目前采用的外标法在操作便捷性方面具有优势，但引入同位素内标值得作为方法进一步完善的优化方向。
3.2 方法在小鼠胰腺组织药代动力学研究中的应用价值与展望
为验证方法的实际应用能力，安逸生物公司设计并实施了一套完整的药代动力学实验，设置0、0.5、1、6、24小时五个采样时间点，每个时间点6只生物学重复动物（n=6），共计30只小鼠。这一实验设计涵盖药物吸收峰（0.5 h）、峰浓度（1 h）、分布相（6 h）和消除相（24 h），能够全面勾画胰腺组织中尼古丁和可替宁的浓度-时间曲线。
从初步检测数据来看，方法展现了良好的区分能力和生物学合理性。空白对照组（0H组, n=6）全部未检出尼古丁和可替宁，证实方法特异性良好，无内源性干扰物质引起假阳性。给药后的各时间点组均检出目标分析物，且浓度呈现与药代动力学预期相符的时间变化趋势。以尼古丁为例，各时间点的均值浓度（ng/g）从给药后立即下降，呈现出经典的单室或多室药代消除特征。可替宁作为尼古丁的主要代谢产物，其浓度变化模式与尼古丁保持一定的时序关系，反映了从母体药物到代谢物的生物转化过程。这些初步数据表明，该方法能够灵敏地捕获尼古丁暴露后胰腺组织中的药物浓度动态变化，为系统性的药代动力学参数计算奠定了基础。
目前，国内外针对尼古丁组织分布的研究主要依赖放射性同位素标记法或全身放射自显影技术，这些方法虽可提供定性分布信息，但无法区分原型药与代谢物，也不具备LC-MS/MS的定量准确性和选择性 [2]。近年来，质谱成像技术（MALDI-MSI）的发展提供了组织内药物空间分布的可视化信息，有研究利用质谱成像方法揭示了尼古丁暴露后小鼠脑内代谢物的空间分布变化 [30]，但与LC-MS/MS相比，其在定量准确性方面仍有差距。安逸生物公司开发的胰腺组织LC-MS/MS检测方法填补了该领域的技术空白，其主要应用价值体现在以下方面：（1）可为尼古丁胰腺毒性机制研究提供组织暴露水平的定量数据；（2）可与血药浓度数据联用计算组织分配系数（tissue-to-plasma ratio），丰富尼古丁的药动学参数体系；（3）方法框架可迁移至其他靶组织（如脑、肝、肺等），形成多组织尼古丁分布的系统评估方案 [21]。
展望未来，该方法可在以下几个方向进一步优化：（1）引入同位素内标（d₃-尼古丁、d₃-可替宁）以更好地补偿复杂的组织基质效应 [23]；（2）扩展检测目标物至3-羟基可替宁和尼古丁-N-氧化物，以全面评估尼古丁代谢谱 [13]；（3）开发基于96孔板的微量组织高通量前处理流程，适配大规模药代动力学研究的需求 [24]；（4）建立系统的方法学验证报告，依据FDA生物分析方法验证指南对选择性、线性、准确度、精密度、回收率和稳定性等关键参数进行全面评估 [7]；（5）探索将代谢物分析方法与质谱成像技术相结合，实现胰腺组织内尼古丁代谢物的空间分布可视化。
结论
液相色谱串联质谱法是目前生物基质中尼古丁和可替宁定量检测的首选技术。经过对现有文献的系统梳理和安逸生物公司检测方法的深入分析，本文得出以下主要结论：
在检测方法标准化方面，目前国内外针对小鼠胰腺等生物组织中尼古丁和可替宁的LC-MS/MS检测尚无现行国家标准、行业标准或团体标准可用。现有与尼古丁/可替宁检测相关的标准均以血液、尿液或烟草制品为基质，无法直接应用于组织样本的定量分析。安逸生物公司自主开发的检测方法在一定程度上填补了这一技术空白。
在技术路线选择方面，HILIC色谱模式相较于传统反相方法在尼古丁等极性小分子的保留和分离方面表现出显著优势，配合MRM双离子对监测策略可确保定性确证的可靠性。超声辅助提取结合冻干浓缩的前处理流程在微量组织检测中兼具操作便捷性和富集效率，为组织药代动力学研究提供了可行的方法学方案。
在方法应用方面，安逸生物公司以30只小鼠的多时间点（0~24小时）实验设计获得了胰腺组织中尼古丁和可替宁的浓度-时间动态数据，初步验证了方法的实际适用性。该方法为尼古丁胰腺毒性的组织暴露评估提供了有力工具，并有望拓展至其他靶组织的多器官药代动力学研究中。
未来研究应重点关注同位素内标的引入以及向3-羟基可替宁等更多尼古丁代谢物的检测扩展，以进一步提升方法的定量准确性和代谢谱覆盖能力。