1. 引言

液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）已成为生物分析领域不可或缺的工具，广泛应用于药物代谢动力学研究、临床诊断、治疗药物监测（TDM）、代谢组学及环境毒物分析等众多领域 [1]。在靶向定量分析中，仪器测量的是分析物在检测器上产生的信号响应（如色谱峰面积或峰高），而定量分析的最终目标是将这些信号强度转化为准确的浓度值。实现这一转化的关键环节便是校准（Calibration），即建立信号响应与分析物浓度之间的函数关系 [2]。

根据校准策略的不同，定量方法主要分为外标法和内标法两大类。外标法通过单独分析一系列已知浓度的标准品构建校准曲线，再依据待测样品的信号响应计算浓度；内标法则在样品处理前向每个样品（包括标准品和未知样品）中加入已知量的内标物质，通过分析物与内标物的响应比值进行定量 [3]。近年来，随着稳定同位素标记内标（Stable Isotope Labeled Internal Standard, SIL-IS）技术的成熟和广泛应用，内标法在复杂生物基质分析中的优势日益凸显。然而，外标法凭借其操作简便、成本低廉等特点，在特定场景下仍具有不可替代的价值。

本综述从检测原理出发，系统分析内标法和外标法在小分子靶向质谱检测领域的技术特点、优劣势及适用场景，旨在为相关领域的研究人员提供方法学选择的参考框架。

2. 靶向质谱定量分析的基本原理

2.1 LC-MS/MS 靶向定量分析的工作流程

LC-MS/MS 靶向定量分析通常遵循以下标准化流程 [4]：

1. 质谱方法开发与优化

   ：对目标分析物进行直接质谱和串联质谱分析，优化离子源参数、去簇电压、碰撞能量等质谱条件，确定最佳母离子-子离子（Precursor → Product Ion）转换对（Transition）。

2. 色谱方法开发

   ：选择合适的色谱柱（通常为反相C18柱）和流动相体系，优化梯度洗脱程序，实现目标分析物与基质干扰物的充分分离。

3. LC-MS/MS 方法验证

   ：评估方法的检出限（LOD），建立校准曲线的线性范围，考察基质效应、分析物稳定性和系统残留效应。

4. 样品前处理

   ：根据分析物的理化性质和样品基质类型，选择合适的前处理方法（如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等），以获得最高的提取效率和最洁净的样品本底。

5. 样品分析

   ：使用已验证的LC-MS/MS方法进行批量样品分析。

2.2 选择反应监测（SRM）/ 多反应监测（MRM）模式

在靶向定量分析中，最常使用的质谱采集模式是选择反应监测（Selected Reaction Monitoring, SRM），也称多反应监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM），该模式通常在三重四极杆质谱仪（Triple Quadrupole MS, QqQ-MS）上执行 [5]。

SRM/MRM 模式的核心原理如下：

• 第一重四极杆（Q1）

  ：选择性通过目标分析物的母离子（Precursor Ion），实现对特定质荷比（m/z）离子的精确分离。

• 碰撞池（Q2）

  ：将母离子通过惰性气体碰撞诱导解离（Collision-Induced Dissociation, CID），产生特征性的碎片离子。

• 第三重四极杆（Q3）

  ：选择性通过特定的子离子（Product Ion），进行第二次质荷比筛选。

这种"双重质量选择"机制赋予了 SRM/MRM 模式极高的选择性和灵敏度。通过母离子和子离子的两步筛选，可以在复杂生物基质中精确锁定目标分析物，有效降低背景噪声，从而提高信噪比和动态范围。在临床代谢组学研究中，采用 LC-MRM-MS 结合标准曲线和同位素内标的方法被认为是最为理想的绝对定量策略 [6]。

2.3 定量分析的基本数学关系

靶向质谱定量分析的基本前提是：在一定浓度范围内，分析物的检测器响应信号（如色谱峰面积 A）与其浓度 C 呈线性关系 [3]：

A=k⋅CA=k⋅C

其中 k 为响应系数或校正因子，取决于分析物的电离效率、色谱行为和仪器检测灵敏度。校准的核心任务就是准确确定这一比例关系。

3. 外标法（External Standard Method, ESTD）

3.1 检测原理

外标法是最直接的定量方法。其基本原理是：使用已知纯度的分析物标准品配制一系列已知浓度的标准溶液，在与待测样品完全相同的色谱和质谱条件下进行分析，建立标准品的信号响应（峰面积或峰高）与浓度之间的校准曲线，然后将待测样品的信号响应带入校准方程计算其浓度 [3]。

3.2 校准曲线的建立

外标法的校准曲线建立包括以下步骤 [7]：

1. 标准溶液配制

   ：使用纯品标准品配制至少6个非零浓度点的标准溶液，覆盖预期的样品浓度范围，通常包含定量下限（LLOQ）。

2. 基质匹配（Matrix-Matched）校准

   ：为获得最优准确度，校准标准品应使用与实际样品相同的生物基质配制，并经相同的样品前处理流程。若无法获得空白基质，可使用纯溶剂配制，但准确性会相应降低 [4]。

3. 曲线拟合

   ：通常采用线性回归（加权或最小二乘法）拟合校准曲线。校准曲线的相关系数 R² 应 ≥ 0.99，各校准点的回算浓度应在标称值的 ±15% 以内（LLOQ 可放宽至 ±20%）。

4. 校准曲线验证

   ：每个分析批开始和结束时应插入校准点以确认仪器响应稳定性，每运行10-15个样品后建议进行一次单点校正 [3]。

外标法的定量公式为 [3]：

Csample=AsampleAstandard⋅CstandardCsample=AstandardAsample⋅Cstandard

其中 C_sample 为待测样品浓度，A_sample 为样品响应值，A_standard 为标准品响应值，C_standard 为标准品已知浓度。

3.3 优势

1. 操作简便

   ：无需在样品中添加任何内标物质，直接通过标准曲线进行计算，实验步骤少，适合大批量样品的快速分析。

2. 无需校正因子

   ：直接依赖校准曲线进行定量，减少了中间转换步骤可能引入的误差。

3. 标准品易于获取

   ：外标法对标准品的要求相对简单，业界有多种商业化的高纯度分析物标准品可供选择。

4. 适用范围广

   ：不需要对色谱图中所有组分都进行完全分离和定性，仅关注目标分析物即可。

5. 成本较低

   ：不需要购买昂贵的内标物质（尤其是同位素标记内标），降低实验成本。

3.4 劣势与局限性

1. 对进样精密度要求高

   ：传统手动进样器的误差约为 ±1%，自动进样器约为 ±0.5%，但在痕量分析中这些误差仍可能导致结果的显著偏差 [3]。

2. 无法补偿前处理损失

   ：外标法仅反映进样后的响应值，无法校正样品在前处理（如萃取、浓缩、衍生化等）过程中由于回收率不完整引入的误差 [3]。

3. 对色谱条件稳定性敏感

   ：流动相组成的波动、柱温的微小变化、检测器灵敏度的漂移等因素都会直接影响定量结果的准确性。

4. 基质效应影响显著

   ：在复杂生物基质（如血浆、血清、尿液等）中，共存物质可导致目标分析物的离子化效率发生增强或抑制（即基质效应），外标法对此无法进行有效补偿 [1]。

5. 需频繁更新校准曲线

   ：为保证分析准确性，每个分析批都需要重新绘制校准曲线，消耗大量的标准品和时间。

4. 内标法（Internal Standard Method, ISTD）

4.1 检测原理

内标法是指在样品处理前，向所有样品（包括校准标准品、质量控制样品和未知样品）中加入已知且相同量的内标物质，然后通过分析物与内标物的响应比值进行定量计算的方法。其核心原理是：内标物与分析物在化学性质上高度相似，二者在经历相同的样品前处理和色谱-质谱分析过程中所产生的系统误差（如提取损失、进样体积偏差、离子化效率变化等）将按相同比例影响其信号响应，因此二者的响应比值可有效抵消这些误差 [3]。

内标法的定量公式如下 [3]：

AanalyteAIS=f⋅CanalyteCISAISAanalyte=f⋅CISCanalyte

其中 A_analyte 和 A_IS 分别为分析物和内标物的峰面积，C_analyte 和 C_IS 分别为分析物和内标物的浓度，f 为相对校正因子。

4.2 内标物的类型与选择标准

4.2.1 稳定同位素标记内标（SIL-IS）

稳定同位素标记内标是内标法的"金标准"，被视为最理想的内标选择。SIL-IS 是用重同位素（如 ²H、¹³C、¹⁵N）标记的分析物类似物，其分子结构与分析物完全相同，仅因同位素组成的差异而具有不同的质量数 [4]。

SIL-IS 的理想特性包括 [4][8]：

• 分子质量比分析物至少高 3 Da，以确保质谱中二者的同位素峰不重叠
• 与分析物具有几乎完全相同的理化性质，包括色谱保留时间、萃取效率和离子化效率
• 在质谱中通过不同的 m/z 与分析物区分

SIL-IS 可在整个分析流程中精确追踪分析物的行为，包括：

• 样品前处理过程

  ：补偿萃取回收率的不完整性

• 色谱分离过程

  ：分析物与 SIL-IS 共洗脱

• 离子化过程

  ：二者经历相同的基质效应（离子抑制或增强）

• 质谱检测过程

  ：校正仪器灵敏度的波动

然而，SIL-IS 也存在一定局限性 [9]：

• 价格昂贵

  ：合成高纯度的稳定同位素标记化合物成本高昂

• 交叉信号干扰

  （Cross-Signal Contribution）：对于含硫、氯、溴等天然同位素分布较宽元素的化合物，分析物的天然同位素峰可能与 SIL-IS 产生信号交叉，导致校准曲线非线性。解决方案包括增加 SIL-IS 浓度或监测 SIL-IS 的低丰度同位素峰。

• 供应有限

  ：并非所有目标分析物都有商品化的 SIL-IS 可供购买。

4.2.2 结构类似物内标

当无法获得稳定的同位素标记内标时，可选用结构类似物（Structural Analog）作为替代。结构类似物内标应满足以下条件 [3]：

• 不存在于待测样品中
• 与分析物具有相似的极性和分子量
• 在色谱条件下获得基线分离（通常要求分离度 Rs > 1.5）
• 化学惰性，不与分析物及基质成分发生反应
• 理化性质稳定，在样品处理、储存和分析过程中不降解

结构类似物内标的缺点在于其色谱行为和离子化效率可能与分析物存在差异，从而影响定量准确性。

4.3 优势

1. 高抗干扰性

   ：可有效抵消进样量误差、流动相波动和检测器灵敏度变化等系统误差 [3]。

2. 补偿前处理损失

   ：若内标物在样品前处理前加入，可校正提取、浓缩等步骤中的分析物损失，获得更准确的回收率校正 [3]。

3. 有效补偿基质效应

   ：SIL-IS 与分析物经历相同的基质环境，二者的响应比值可有效消除离子抑制或增强带来的偏差，是解决复杂生物基质中定量问题的最有效手段 [10]。

4. 高准确度和精密度

   ：内标法的定量准确度可达 ±0.25%，适合低含量组分的精确分析，满足 FDA、EMA 和 ICH 等监管机构的法规要求 [1]。

5. 方法稳定性好

   ：即使仪器长期运行后灵敏度发生漂移，分析物与内标物的比值仍可保持稳定，支持更长的样品分析批次。

4.4 劣势与局限性

1. 操作繁琐

   ：需精确称量和添加内标溶液至每个样品中，增加了实验操作的复杂性和工作量 [3]。

2. 内标选择困难

   ：理想的内标物需满足化学性质相似、不存在于样品中、不与目标分析物干扰、在色谱中完全分离等多个条件，这在多组分同时分析时尤为困难。

3. 成本较高

   ：特别是稳定同位素标记内标的价格通常为分析物标准品的数倍至数十倍，显著增加分析成本 [3]。

4. 潜在干扰风险

   ：内标物可能与目标分析物产生交叉信号干扰，或内标物本身含有微量的目标分析物杂质。

5. 分离度要求

   ：结构类似物内标需与所有分析组分在色谱上完全分离，增加了色谱方法开发的复杂性 [3]。

5. 内标法与外标法的系统比较

5.1 准确度与精密度

在理想条件下（简单基质、仪器状态稳定），外标法的准确度和精密度可以满足常规分析的需求。然而，对于复杂生物基质中超痕量水平（如 ppb 级）的分析物测定，内标法的优势十分明显。FDA 生物分析方法验证指南明确推荐在 LC-MS/MS 生物分析中使用内标法 [1]。

5.2 基质效应补偿能力

基质效应是 LC-MS/MS 定量分析中最重要的干扰因素之一，指的是样品中的共存组分对目标分析物离子化效率的改变，可表现为离子抑制（Ion Suppression）或离子增强（Ion Enhancement）。基质效应评估是方法验证的必要环节 [10]：

• 外标法

  对基质效应高度敏感，在复杂生物样品中可导致 30%-50% 以上的定量偏差

• 内标法

  （特别是采用 SIL-IS 时）可有效补偿基质效应，因为内标物与分析物基本共洗脱，经历相同的离子化环境

5.3 成本与操作复杂度的权衡

5.4 方法验证方面的要求差异

根据 ICH M10、FDA 和 EMA 生物分析方法验证指南，两种方法在验证要求上存在差异 [1]：

• 外标法

  验证中需额外关注：仪器进样精密度的量化、批间响应一致性的长期监测、基质匹配校准的标准品来源验证。

• 内标法

  验证中需额外关注：内标物添加的一致性和稳定性、内标物与分析物响应比值的时间稳定性、内标物的纯度认证及交叉信号贡献评估。

6. 适用实验场景分析

6.1 推荐采用外标法的实验场景

6.1.1 简单基质样品分析

对于样品基质相对简单、干扰成分少的分析对象，如饮用水中农药残留筛查、化学试剂纯度检测、片剂/注射液中主成分含量测定（通常主成分含量 ≥ 95%）等场景，外标法简便高效且准确度足可满足要求 [3]。

6.1.2 大批量样品高通量筛选

在药物发现早期的体外代谢稳定性筛选、先导化合物优化等阶段，样品数量大（通常数百至数千个），对单个数据的准确度要求相对较低，外标法结合自动进样系统可实现高通量、低成本的批量分析。

6.1.3 工业质量控制与常规检测

在原料药的质量检测、制剂溶出度实验、生产过程监控等场景中，样品基质相对一致且分析物浓度水平较高，外标法足以满足 GMP 和药典标准的要求。美国药典（USP）和英国药典（BP）中多种原料药的含量测定方法即采用外标法 [3]。

6.1.4 非靶向代谢组学中的半定量分析

在高分辨质谱进行非靶向代谢组学筛查时，由于关注的代谢物数目庞大（数百至数千个），难以逐一匹配内标物，通常采用外标法进行相对定量或半定量分析。

6.2 推荐采用内标法的实验场景

6.2.1 复杂生物基质中的定量分析

当分析对象为生物基质（全血、血浆、血清、尿液、组织匀浆等）中的目标分析物时，建议优先采用内标法。生物样品中的蛋白质、磷脂、盐类等成分可引发显著的基质效应，内标法（特别是 SIL-IS）是最有效的补偿手段。例如，血浆中药物代谢物的含量测定、组织中内源性生物标志物的定量等均强烈推荐使用内标法 [1]。

6.2.2 临床药代动力学（PK）与毒代动力学（TK）研究

PK/TK 研究对定量数据的准确度和精密度要求极高，需符合 FDA/EMA GLP 规范。浓度-时间曲线的微小偏差可能导致半衰期、AUC、Cmax 等关键参数的严重失真。目前，无论是药物开发阶段的临床前 PK 研究还是人体临床试验中的生物样品分析，内标法均为行业标准操作 [1]。

6.2.3 治疗药物监测（TDM）

TDM 需精确测定患者血浆中的药物浓度以指导个体化给药方案的调整（如免疫抑制剂、抗癫痫药物、抗肿瘤药物等），定量偏差可能直接影响临床决策。采用 SIL-IS 的 LC-MS/MS 方法是目前 TDM 领域的主流方案 [6]。

6.2.4 生物等效性研究

生物等效性（BE）研究要求对测试制剂和参比制剂的药代参数进行严格的统计比较，对定量方法的重现性和准确性要求极为严格，必须采用内标法。

6.2.5 痕量物质测定

当需要检测 ppb 乃至 ppt 级别的痕量目标物时（如环境水中多环芳烃的检测、食品中真菌毒素的筛查），系统误差的任何放大都会导致结果不可靠，内标法通过比值校正可以大幅降低检测限附近的定量变异性 [3]。

6.2.6 靶向代谢组学的绝对定量验证

在非靶向代谢组学发现候选生物标志物后，进入靶向绝对定量验证阶段时，通常采用 LC-MRM-MS 法结合同位素标准曲线法来实现准确的绝对定量，确保多中心研究结果的可比性 [6]。

6.3 方法选择的决策框架

在实际应用中，可综合考虑以下因素进行方法选择 [3]：

7. 基质效应的评估与应对策略

7.1 基质效应的产生机制

在 LC-MS/MS 分析中，基质效应主要源于与目标分析物共洗脱的基质组分（如磷脂、盐类、代谢产物等）在电喷雾离子化（ESI）过程中竞争液滴表面的电荷，从而改变目标分析物的离子化效率。当基质组分减少分析物的离子化效率时，表现为离子抑制；反之则为离子增强 [10]。

7.2 基质效应的评估方法

推荐采用柱后灌注法（Post-Column Infusion）或提取后加标法（Post-Extraction Spiking）进行基质效应评估：

• 制备空白基质经前处理后的提取液
• 在提取液中加入已知浓度的目标分析物
• 与纯溶剂中相同浓度的分析物信号进行比较
• 基质因子（Matrix Factor, MF） = 基质中分析物响应 / 纯溶剂中分析物响应
• 内标归一化的基质因子（IS-normalized MF）可进一步评估内标法的补偿效果 [10]

7.3 基质效应的应对策略

当采用内标法（尤其是 SIL-IS）时，基质效应可得到基本补偿。若基质效应仍然显著，可进一步采取以下策略 [10]：

• 优化色谱条件，使目标分析物远离基质干扰区域洗脱
• 改进前处理方法，采用固相萃取（SPE）或液液萃取等更有效的净化手段
• 考虑切换离子化模式（如从 ESI 切换为 APCI）
• 使用标准加入法（Standard Addition Method）作为校准手段

8. 总结与展望

内标法与外标法是靶向质谱小分子定量的两种基本策略，各自在检测原理、操作流程、技术特点和适用场景上存在显著差异。外标法以操作简便、成本低廉、适合自动化高通量分析见长，主要适用于简单基质中中高浓度分析物的常规检测。内标法（特别是稳定同位素标记内标法）通过分析物与内标物响应比值的校正，可有效补偿样品前处理损失、基质效应和仪器波动，在复杂生物样品的痕量分析和法规驱动的高精度研究中具有不可替代的优势。

随着LC-MS/MS技术在临床实验室中的普及和标准化进程的推进，内标法的应用范围正在持续扩大 [2]。尤其是在精准医学时代，靶向代谢组学生物标志物从发现到临床转化的过程中，采用 SIL-IS 的 LC-MRM-MS 绝对定量方法正成为连接科研发现与临床应用的关键桥梁 [6]。

展望未来，内标法的发展趋势包括：（1）合成成本更低、种类更丰富的 SIL-IS 产品，降低方法应用门槛；（2）多组分同步定量分析中智能化内标匹配策略的开发；（3）人工智能辅助的内标选择与色谱分离条件优化；（4）微型化、自动化样品前处理系统与在线内标添加的整合，进一步提升分析通量和数据质量。

参考文献

[1] Quantitative Analysis Guide: Internal vs. External Standards in LC-MS/MS Bioanalysis. BenchChem, 2026. (引用 ICH M10 Guidance, FDA Bioanalytical Method Validation Guidance, EMA Guideline on Bioanalytical Method Validation)

[2] Calibration Practices in Clinical Mass Spectrometry: Review and Recommendations. Ann Lab Med, 2023.

[3] Internal Standard vs. External Standard Methods in Chromatographic Quantification: A Comprehensive Protocol Guide. Alfa Chemistry Resources, 2025.

[4] LC-MS/MS Quantitative Assays. UNC Department of Chemistry Mass Spectrometry Core Laboratory. (引用 FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry)

[5] Quantitation — Small Molecules. Stanford University Mass Spectrometry (SUMS), 2024.

[6] Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Predictive, Preventive, and Personalized Medicine. Frontiers in Molecular Biosciences, 2022, 9:1049016.

[7] Skyline Small Molecule Quantification Tutorial. MacCoss Lab, University of Washington, 2025.

[8] Stable Isotopically Labeled Internal Standards in Quantitative LC-MS/MS Drug Analysis. Anal Chem, 2019.

[9] Radovanovic M, Jones G, Day RO, et al. Mitigating Analyte to Stable Isotope Labelled Internal Standard Cross-Signal Contribution in Quantitative LC-Tandem Mass Spectrometry. J Mass Spectrom Adv Clin Lab, 2022, 24:57-64.

[10] Strategies for Detection and Elimination of Matrix Effects in Quantitative LC-MS Analysis. Chromatography Online, 2024.