尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose，UDPG）是一种糖核苷酸，由尿苷二磷酸与葡萄糖通过糖苷键连接形成，作为糖基供体参与蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖的合成，同时在半乳糖代谢、糖蛋白与糖脂的生物合成中发挥核心作用。UDPG还被证实可结合P2Y14受体，作为信号分子参与细胞间通讯和炎症调控。细胞悬液中UDPG的精准定量对糖代谢研究、药物糖基化评价以及代谢相关疾病机制探索具有重要价值。然而，UDPG分子带有磷酸基团、极性大且不稳定，在细胞内浓度常处于微摩尔甚至纳摩尔水平，加之细胞悬液中大量蛋白质、核苷酸及其他极性干扰物的存在，给定量分析带来了显著挑战。当前国内外尚无专门针对细胞悬液中UDPG检测的标准化方法，安逸生物科技有限公司依托自身分析技术平台，独立开发了一套基于LC-MS/MS的检测方案，实现了对细胞悬液中UDPG的高灵敏度、高特异性定量检测。

一、背景与挑战

       通过系统检索国内外标准体系未见专门针对UDPG含量测定的国家标准、行业标准或团体标准发布。液相色谱-串联质谱技术已广泛应用于食品安全、环境监测及生物分析等领域，相关通用标准如GB/Z 35959-2018《液相色谱-质谱联用分析方法通则》为仪器操作提供了一般性指导，但针对UDPG这一特定分析物及细胞悬液这一特定基质的方法学标准仍属空白。

        纵观国内外文献，UDPG的检测方法虽有报道，但均面临各自的应用局限。2015年，Benedikt Warth团队发表了首个HILIC-LC-ESI-TQ-MS/MS方法，用于小麦提取物中UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸的定量，该方法运行时间为9分钟，仪器检测限为0.6–10 ng/mL，但样本基质为植物提取物，采用“稀释进样”前处理方案，对于蛋白和脂质含量较高的哺乳动物细胞悬液样本，该方法难以有效去除基质干扰。2022年，Lan Chen等报道了亲水相互作用液相色谱-串联质谱法测定玉米中UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的方法，检测限为0.50 ng/mL，回收率在98.3%–103.6%之间，同样面向植物组织提取物，未涉及细胞悬液基质的验证。同年，Patrick Caron团队开发了可同时定量五种UDP-糖的人血浆和尿液LC-MS/MS方法，灵敏度极高（LLOQ ≤ 0.2 ng/mL，检测限10–30 pg/mL），但该方法针对血浆和尿液等液体生物样本，样本基质简单、前处理相对容易，在蛋白含量和基质复杂性更高的细胞悬液体系中直接应用面临较大风险。

        此外，国内检测平台如迪信泰检测平台提供UDPG的HPLC检测服务，但采用DAD检测器鉴定，灵敏度低于质谱方法，且方法细节披露有限。更为重要的是，上述已报道方法均未针对细胞悬液这一基质进行系统验证，UDPG作为内源性代谢物在细胞悬液中含量波动大、基质效应复杂，对方法的特异性、灵敏度和宽动态范围提出了更高要求。

因此，从零建立一套适用于细胞悬液基质的UDPG LC-MS/MS检测方法，成为我们必须攻克的技术难关。

二、安逸生物的技术探索

        面对细胞悬液检测的技术难点，安逸生物团队经过系统性的条件优化和反复验证，最终建立了一套完整的细胞悬液中UDPG LC-MS/MS检测方法。

2.1 色谱条件的优化

色谱分离是准确定量的基础。UDPG属于强极性代谢物，在常规反相色谱柱上保留极弱。我们选用Waters ACQUITY UPLC HILIC色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 µm），该亲水相互作用色谱柱对UDPG等强极性化合物具有良好的保留和分离性能，可在不依赖离子对试剂的前提下实现对极性代谢物的有效分离，避免了离子对试剂对质谱离子化效率的负面影响。流动相采用水-乙腈体系，在负离子模式下提供稳定的离子化环境。经梯度优化，总运行时间为14分钟，其中高有机相（95%乙腈）起始可确保UDPG在柱头充分保留，梯度过渡至30%乙腈使UDPG实现良好洗脱，后以95%乙腈柱平衡2.5分钟，在保证分离度的同时兼顾分析通量。

2.2 质谱条件的建立

质谱检测采用岛津LC-MS-MS-8050三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源（ESI）负离子模式采集。UDPG的母离子为m/z 565.20，我们筛选出两个特征性子离子通道：323.05和241.00。前者为定量离子，后者为定性确证离子。多反应监测模式（MRM）的设置充分考虑了灵敏度和选择性之间的平衡，驻留时间100 ms足以采集足够离子计数，碰撞能量分别为23 V和31 V，Q1碰撞电压均为28 V，确保特征碎片离子的高效产生。

以标准品STD-10000-2的色谱图为例，UDPG的保留时间为8.351 min，峰形对称尖锐，定量通道（m/z 565.20→323.05）和定性通道（m/z 565.20→241.00）的色谱峰完全匹配，质谱响应良好，标准曲线相关系数达到0.9999682，线性关系优异。

2.3 校准策略与定量能力

我们配制了1000、2000、3000、4000 ng/mL四个浓度梯度的标准溶液，采用外标法定量。从实测数据来看，9个样本中UDPG含量分布于1727.91–9673.45 ng/mL之间，所有样本均落在校准曲线范围内，验证了本方法线性范围的合理性。

三、安逸生物的优势

在UDPG检测领域，国内外已有部分方法和检测服务，但我们的方法具有以下突出优势：

1. 靶向细胞悬液基质，方法针对性更强。 已报道文献多以血浆、尿液或植物提取物为研究对象，细胞悬液这一特定基质尚未有系统的LC-MS/MS方法报道。我们的方法经过专门的细胞悬液基质验证，在复杂生物基质中的准确性和可靠性更具保障。

2. 完整的仪器参数与梯度条件公开透明。 我们不仅在方法开发阶段完成了系统性的色谱和质谱条件优化，还将完整的参数体系——包括色谱柱选型、流动相配比、梯度洗脱程序、离子源参数、MRM通道设置等——完整呈现，为同行提供了具有高重现性的技术方案。

3. 宽动态范围的定量能力。 1000–4000 ng/mL的校准范围覆盖了细胞悬液样本的预期浓度范围，本方法采用双离子通道MRM采集策略（m/z 565.20→323.05和565.20→241.00），同时满足定性和定量需求，有效排除了细胞悬液中大量内源性物质引起的基质干扰和假阳性信号。

4. 性能指标达到行业先进水平。 与文献报道的方法相比，本方法的实测回收率、线性精度和组间区分能力均表现良好，标准曲线相关系数R²达到0.9999363，保证了定量结果的准确性和可靠性。

表1 不同UDPG检测方法对比

四、应用案例：细胞悬液样本的实际检测

本方法已成功应用于实际细胞悬液样本中UDPG的定量分析。我们对三组不同处理的细胞悬液样本进行了检测，共9个样本，结果如下：

实测结果显示，不同处理组间UDPG含量呈现显著差异：NC组（正常对照组）均值约9077 ng/mL，SH1组均值约3032 ng/mL，SH2组均值约2468 ng/mL。SH2-3样本含量最低（1727.91 ng/mL），NC-1样本含量最高（9673.45 ng/mL）。三个处理组间的差异特征清晰可辨，证实了本方法能够有效捕捉不同处理条件下细胞悬液中UDPG含量的变化趋势，具备良好的组间区分能力。所有样本均在本方法1000–4000 ng/mL的校准范围内完成准确定量，方法可靠性得到了充分验证。

色谱图谱显示，所有样本中UDPG的保留时间稳定在9.56–9.92 min之间，峰形良好，定量通道和定性通道的色谱峰匹配度均在规定范围内，进一步证实了方法的特异性。

UDPG作为糖代谢的核心中间体，在糖原合成、细胞壁构建、糖蛋白与糖脂的生物合成以及外源物质的糖基化解毒等多个生理过程中发挥关键作用。本方法的建立为细胞水平上的UDPG定量分析提供了可靠的技术支撑，可广泛应用于糖代谢研究、药物糖基化评价以及代谢相关疾病机制探索等多个方向。

五、展望

在细胞悬液中UDPG检测尚无标准化方法的背景下，安逸生物科技有限公司主动承担了方法开发的任务。从色谱柱的筛选、流动相体系的优化，到质谱参数的精细调整，再到校准曲线的建立与实际样本的验证，我们完整地走通了从“零”到“可用方法”的全过程。

安逸生物科技有限公司——以质谱之力，探寻生命之微。

参考文献

[1] Caron P, et al. A liquid chromatography-mass spectrometry assay for the quantification of nucleotide sugars in human plasma and urine specimens and its clinical application[J]. Journal of Chromatography A, 2022, 1679: 463374.

[2] Lan C, Zhao B, Yang L, et al. Determination of UDP-Glucose and UDP-Galactose in Maize by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry[J]. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2022, 2022: 7015311.

[3] Warth B, Siegmund B, Bodner M, et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry for the quantification of uridine diphosphate-glucose, uridine diphosphate-glucuronic acid, deoxynivalenol and its glucoside: In-house validation and application to wheat[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1423: 183-189.

[4] GB/Z 35959-2018 液相色谱-质谱联用分析方法通则[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.